Microsoft word - bericht 13

Methoden zur Untersuchung und Beurteilung
der Fliessgewässer in der Schweiz
Vorschläge zur Vorgehensweise
im Modul Ökotoxikologie
Nina Schweigert1, Rik I.L. Eggen1, Beate I. Escher1, Patricia Burkhardt- 1Umweltmikrobiologie und molekulare Ökotoxikologie, EAWAG, Überlandstr. 135, 8600 Dübendorf; 2Fischnetz, EAWAG, Überlandstr.
2.1.1. Das Modul-Stufen-Konzept (MSK) . 5 2.2.2. weitere Möglichkeiten ökotoxikologischer Wasseruntersuchungen . 8 3. DAS KONZEPT FÜR DAS MODUL ÖKOTOXIKOLOGIE. 14 3.2. Stufe 1: Screening von Wasserproben auf ihr toxisches Potential . 16 3.2.1. Auswahl der Vorgehensweise anhand eines Kriterienkataloges . 16 3.2.2. Die Screening-Testbatterie der 1. Stufe. 18 3.4. TIE (Toxicity-Identification-Evaluation) . 22 4. DAS MODUL ÖKOTOXIKOLOGIE IM RAHMEN DES MSK. 22 In diesem Bericht wird ein Konzept vorgestellt, mit dem eine ökotoxikologische Fliessgewässerbewertung im Rahmen des Modul-Stufen-Konzeptes (MSK) durchge- führt werden kann. Dieses Konzept wurde an der EAWAG durch eine interdisziplinä- re Arbeitsgruppe ausgearbeitet. Dabei wurde nach einem Kriterienkatalog vorgegan- gen, in dem, neben der Sensitivität unter anderem auch der Zeitaufwand für den Test, die Handhabbarkeit und die Kosten für die Auswahl von Testsystemen eine entschei- dende Rolle gespielt haben. Dadurch soll ein routinemässiger Einsatz ermöglicht wer- Dieses Konzept sieht eine zweistufige Untersuchung der Wasserproben vor. In der 1.
Stufe wird mittels einer zellulären Screening-Testbatterie das toxische Potential der Proben ermittelt. Mit dieser Testbatterie sollen die meisten relevanten toxischen Ant- worten (z.B. DNA-Schäden oder Photosynthese-Hemmung) abgedeckt werden. In der 2. Stufe werden nur noch Proben untersucht, in denen in der 1. Stufe ein toxisches Potential entdeckt wurde. In dieser 2. Stufe wird anhand von ausgewählten Organis- men überprüft, ob das toxische Potential auch in Organismen zu negativen Effekten führt. Die zu testenden Organismen und der Versuchsaufbau sind, je nach identifi- ziertem toxischem Potential und je nach Probenahmestelle, zu wählen. Das heisst, dass bei einem toxischen Potential im Rhein bei Basel, Fische, Invertebraten oder Algen (je nach toxischer Antwort) eingesetzt werden, die in diesem Gebiet anzutref- fen sind. Bestätigt sich die Toxizität der Proben in der 2. Stufe nicht, so werden keine weiteren Massnahmen ergriffen, da davon ausgegangen werden kann, dass die Proben zwar ein toxisches Potential besitzen, welches in den Organismen aber nicht zu Schä- den führt. Werden die Organismen in den Tests der 2. Stufe aber geschädigt, so muss versucht werden, dass der oder die Schadstoffe identifiziert werden, um eine Redukti- on der Einleitung in das Gewässer zu erreichen. Mit dieser Vorgehensweise können viele Proben gleichzeitig auf ihr toxisches Potential untersucht werden.
Der hier vorgestellte Ansatz kann später auch für die Beurteilung von Umweltproben (z.B. Kläranlagenausläufen, Sickerwasser, Sedimentproben) eingesetzt werden. Die Testmethoden der 1. Stufe können auch für die Chemikalienbewertung herangezogen werden. Zur Klärung der zahlreichen, noch offenen Fragen bei der Umsetzung dieses Konzeptes wird deshalb an der EAWAG zur Zeit eine Machbarkeitsstudie durchge- führt. Dabei wird zuerst die zelluläre Screening-Testbatterie aufgebaut und ausgete- stet, in einem zweiten Schritt werden dann auch Verfahren der 2. Stufe ausgetestet.
Bevor das Konzept vorgestellt wird, wird noch ein Überblick über ökotoxikologische Ansätze gegeben. Diese Ansätze werden hinsichtlich ihrer Potentiale und Grenzen und hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Modul Ökotoxikologie des Modul-Stufen- Die Schweizer Fliessgewässer haben im Laufe der letzten Jahrhunderte nicht nur ein- schneidende Veränderungen bezüglich ihrer Hydrologie und Morphologie erfahren, sondern auch in den physikalischen (z.B. Temperatur) und chemischen Eigenschaften (Bonga, 1997; Bundi et al., 1997; Wagner et al., in press). In einem Grossteil der Schweizer Fliessgewässer leiten Kläranlagen ihre geklärten Abwässer ein, in denen noch geringe Konzen trationen Schadstoffe aus Industrie und Haushalt enthalten sind.
Eine weitere Schadstoffquelle ist das Regenwasser, welches Chemikalien von Strassen, Dächern und aus der Landwirtschaft in die Gewässer einschwemmt. Es ist daher sinnvoll, bei einer ökotoxikologischen Untersuchung nicht nur die Ausläufe von Kläranlagen zu untersuchen, sondern auch im Fliessgewässer selbst Proben zu neh- men, da sonst die Effekte von Schadstoffen aus diffusen Quellen und deren Wechsel- wirkungen mit anderen Schadstoffen unbeachtet bleiben. Desweiteren ist es wichtig, auch die Sedimente auf ihr ökotoxikologisches Potential hin zu untersuchen, da eine ganze Reihe von Chemikalien die Tendenz hat, sich im Sediment anzureichern (Hill et al., 1993). Diese Chemikalien gefährden zum einem die im Sediment lebenden Or- ganismen, zum anderem sind sie aber auch deshalb besonders wichtig, weil sie noch nach langen Zeiträumen aus dem Sediment mobilisiert, wodurch sie noch lange eine potentielle Gefahr für die Fliessgewässer darstellen (Power and Chapman, 1992).
In den letzten Jahrzehnten hat sich die Erkenntnis durchgesetzt, dass Chemikalien- belastungen zu starken Schäden in aquatischen Ökosystemen führen können. Deshalb wurde der Eintrag anthropogener Stoffe (z.B. EDTA) durch gesetzliche oder freiwil- lige Beschränkungen im Abwasser, welches in die Kläranlagen gelangt, deutlich re- duziert und zum anderem wurde die Leistung vieler Kläranlagen verbessert. Dadurch konnten die Einträge von Stickstoffen und anderen Schadstoffen massiv gesenkt werden (Bundi et al., 1997). Dennoch gelangen noch Tausende von Haushalts- und Industriechemikalien in die Oberflächengewässer, die dort als ein undefiniertes Ge- misch vorliegen. Viele dieser Chemikalien sind mit chemischen Analysen nicht oder nur mit aufwendigen Methoden nachzuweisen. Wenn mehrere Chemikalien mit glei- chen Wirkmechanismen vorliegen, können diese zu Schadeffekten führen, indem sich ihre Effekte aufaddieren. Das kann auch dann der Fall sein, wenn die Einzelkonzen- trationen unterhalb der Wirkschwelle der Einzelstoffe liegen (Tonkes et al., 1998).
Auch synergistische Effekte können in Chemikaliengemischen auftreten (Schweigert et al., 2001). Die Frage ist, welchen Einfluss dieses Gemisch von Chemikalien und ihren Metaboliten, bei den heute vorliegenden – vergleichsweise niedrigen – Einzel- konzentrationen, auf die Ökosysteme unserer Fliessgewässer hat. Dass auch die nied- rigen Chemikalienkonzentrationen, bei chronischer Exposition, schwerwiegende Schäden in Organismen verursachen können, haben Untersuchungen an Muscheln und Fischen gezeigt (Fent, 1996; Vos et al., 2000). Weil die Schadstoffkonzentratio- nen in den Gewässern aber meistens so niedrig sind, dass Schäden erst nach langen Expositionen auftreten, wird es unvermeidlich sein, die Wasserproben aufzukonzen- trieren. Hierzu sind bereits eine Reihe von Methoden beschrieben und zum Teil an der EAWAG etabliert (Hendriks et al., 1994; Parkerton et al., 2000; Verbruggen et al., Es ist schwer die Einflüsse von Schadstoffen im Ökosystem von anderen Einflüssen zu unterscheiden, hier kann die Ökotoxikologie eine Hilfestellung leisten, indem sie den Einfluss von Wasserproben auf den Gesundheitszustand von Organismen/Zellen In der Ökotoxikologie gibt es normierte Testverfahren, mit denen die Schadwirkung von Chemikalien und Wasserproben auf Organismen getestet werden können. Bei diesen Standardtests werden die Organismen in der Regel für mehrere Tage (in selte- neren Fällen auch Wochen) einer Wasserprobe unter standardisierten Bedingungen ausgesetzt. Am Ende des Experimentes wird die Konzentration des Schadstoffes oder Abwassers bestimmt, bei der 50% der Organismen offensichtliche Schäden aufweisen (EC50) und die Konzentration, bei der keine Effekte zu beobachten sind (NOEC = No Effect Concentration). Mit Hilfe dieser Werte und unter Anwendung von Sicherheits- faktoren werden die Konzentrationen berechnet, die in der Umwelt nicht überschritten werden dürfen. Zwar gibt es unter den normierten Testsystemen chronische Tests, diese werden aber, bedingt durch den relativ hohen Arbeitsaufwand, bei Umweltpro- In der Forschung werden noch viele andere ökotoxikologische Verfahren verwendet, die aber bei routinemässigen Wasserqualitätsbestimmungen heute noch nicht einge- setzt werden. Einige dieser Methoden werden weiter unten diskutiert.
Das MSK wurde für eine Fliessgewässerbewertung in der Schweiz entwickelt (BUWAL, 1998). Es soll einer umfassenden Bewertung der Fliessgewässer dienen. Es ist ein Ansatz, bei dem die Fliessgewässer in neun verschiedenen Modulen bewertet werden: Hydrologie, Ökomorphologie, Chemie, Ökotoxikologie und fünf verschiede- ne Biologiemodule: Ufervegetation, Makrophyten, Algen, Makrozoobenthos und Fi- sche. Die Stufen bezeichnen die Grösse des zu untersuchenden Gebietes: (F) flächen- deckend, d.h. alle Fliessgewässer in einem Gebiet (z.B. Kanton); (S) systembezogen, d.h. ein Fliessgewässer mit seinen Zuflüssen und (A) abschnittsbezogen ein Abschnitt eines Fliessgewässers. Je nach Stufe werden innerhalb der Module mehr oder weniger intensive Untersuchungen durchgeführt.
In der Gewässerschutzverordnung von 1998 sind die ökologischen Ziele des Gewäs- serschutzes und die Anforderungen an die Wasserqualität neu definiert worden: Dem- nach sollen keine künstlichen, langlebigen Stoffe in die Fliessgewässer eingetragen werden und es soll keine Bioakkumulation solcher Stoffe stattfinden. Die Konzentra- tion anthropogener Stoffe soll im Gewässer nahe bei Null liegen und biologische Pro- zesse sollen nicht beeinträchtigt werden (Gewässerschutzverordnung, 1998). Um die- se Qualitätsziele überprüfen zu können, sind ökotoxikologische Untersuchungen not- wendig. Im nächsten Abschnitt wird sowohl die Ökotoxikologie im Allgemeinen, als auch ökotoxikologische Testverfahren vorgestellt.
Die Ökotoxikologie befasst sich mit wissenschaftlichen Grundlagen und Methoden, mit deren Hilfe Störungen von Ökosystemen durch anthropogene stoffliche Einflüsse und durch Strahlen identifiziert sowie bewertet werden (Steinberg et al., 1995). Das Modul Ökotoxikologie des MSK versucht, Methoden zur Verfügung zu stellen, mit denen eine Überprüfung der oben genannten Ansprüche möglich wird.
Ökotoxikologische Tests umfassen Labor- und Freilandversuche, welche die Wir- kung eines Schadstoffes oder eines Schadstoffgemisches auf ein Ökosystem oder auf einen Teil eines Ökosystems simulieren.
Die wichtigsten Vorteile ökotoxikologischer Tests im Vergleich zu chemischen Ana- (i) dass sie die Effekte aller in der Wasserprobe vorliegenden Chemikalien integrie- ren. Mit chemische Analysen können nur eine begrenzte Anzahl von Chemikali- (ii) dass die Bioverfügbarkeit (Aufnahme und Bioakkumulation) der Schadstoffe mit berücksichtigt wird. (Ausnahmen hierzu sind molekulare und zum Teil auch sub- (iii) dass sie nicht nur das Vorhandensein und die Konzentration eines Schadstoffes aufgezeigt wird, sondern auch seine Wirkung auf Organismen.
(iv) dass auch die Wirkungen von Abbauprodukten mit untersucht werden. Abbau- produkte werden bei chemischen Analysen nur teilweise berücksichtigt.
(v) dass Effekte, die durch die Wechselwirkung von Schadstoffen untereinander oder mit natürlichen Stoffen stattfinden (z.B. Synergien und Antagonismen) mit be- Heute werden ökotoxikologische Methoden für die Bewertung von Oberflächenge- wässer, Abwässer, Sickerwässer, Sedimentextrakte und bei der Chemikalienbewer- tung eingesetzt. Für Routineuntersuchungen kommen hauptsächlich standardisierte Verfahren zum Einsatz, während in der Forschung noch eine ganze Reihe anderer Methoden Verwendung findet. Auf diese Methoden wird im Kapitel 2.2.2. näher ein- gegangen. Bei der Entwicklung des Moduls Ökotoxikologie wurden sowohl die stan- dardisierten, als auch die nicht standardisierten Verfahren berücksichtigt.
Die ersten Bemühungen zur Entwicklung und Standardisierung aquatischer Tests zur Feststellung akuter Toxizität datieren aus den fünfziger Jahren. In den siebziger Jah- ren wurden in einigen Regierungsrichtlinien die ersten Tests bezüglich Gewässer- schutz aufgenommen (Rand et al., 1995). Seither sind einige Testverfahren auf natio- naler und internationaler Ebene standardisiert worden, insbesondere durch die Orga- nisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit (OECD) die Internationale Normenorga- nisation (ISO), die deutsche Industrienorm (DIN) oder die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten (U.S. EPA). In Tabelle 1 sind die aquatischen, ökotoxikologi- schen Testverfahren zusammengestellt, die bis 2000 in die OECD Richtlinien aufge- Tabelle 1: Von der OECD bis 2000 registrierte Test zur aquatischen Ökotoxikologie (OECD,
2000).
Seit 10 bis 20 Jahren werden diese Tests bei der Bewertung der Ökotoxizität komple- xer Proben aus der Umwelt (z.B. Abwasser) eingesetzt. Die chronischen Tests kom- men zwar bei der ökotoxikologische Risikobewertung von Chemikalien zum Einsatz, bei der Risikobewertung von Umwelt- und Abwasserproben ist dies aber aus Kosten- gründen fast nie der Fall. In der Schweiz sind keine ökotoxikologischen Untersuchun- gen der ARA-Ausläufe erforderlich (Gewässerschutzgesetz 1991). In den Nieder- landen ist eine ökotoxikologische Bewertung von ARA-Ausläufen geplant (de Graaf et al., 2000). Dabei können besonders toxische Abwässer erkannt werden und mit Hilfe von chemischen Analysen kann eine Identifikation des oder der Schadstoffe stattfinden. Für niedrige Schadstoffkonzentrationen, wie sie in den Gewässern vorlie- gen, sind diese akuten Tests aber zu unempfindlich.
In der Forschung werden in den letzten Jahren vermehrt zelluläre Testsysteme, mit Einzellern oder Zelllinien höherer Organismen, entwickelt. Diese Tests sind aber noch nicht validiert und nicht normiert.
2.2.2. weitere Möglichkeiten ökotoxikologischer Wasseruntersuchungen Ökotoxikologische Testverfahren können nach verschiedene Gesichtspunkten geord- net werden. In diesem Bericht wurden sie nach biologischen Ebenen vom Molekül bis zum Ökosystem geordnet. Die grössten Unterschiede bei ökotoxikologischen Unter- suchungen auf den verschiedenen biologischen Ebenen sind einerseits die zunehmen- de Integration der toxischen Antworten von der molekularen Ebene zum Ökosystem und andererseits die Unterschiede in der Wahrscheinlichkeit, falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu erhalten. Falsch-negative Ergebnisse sind negative Er- gebnissen im gewählten Testverfahren, die gleiche Probe gibt aber ein positives Er- gebnis auf einer höheren Ebene. Bei falsch-positiven ist es umgekehrt: Im gewählten Testverfahren ergibt sich eine positive Antwort, während auf den höheren Ebenen kein Schadeffekt zu messen ist. Im folgenden Abschnitt werden die Ebenen kurz vor- Die Wirkung von Stressfaktoren (u.a. Schadstoffen), die einen Organismus oder sogar ein Ökosystem beeinflussen, etablieren sich zuerst auf der molekularen Ebene. So können als erste Effekte oft Veränderungen in der Struktur von Proteinen, der DNA oder Membranlipiden festgestellt werden. Auf dieser Ebene sollte es möglich sein, alle Schäden zu entdecken, daher sollte es auf der molekularen Eben keine falsch- negativen Ergebnisse geben. Es wäre aber eine sehr grosse Anzahl von Tests notwen- dig, um alle möglichen toxischen Effekte auf dieser Ebene abzudecken. Deshalb ist eine Integration notwenig, die erreicht wird, wenn die Schäden auf einer höheren Ebene gemessen werden. Eine erste Integration bieten subzelluläre Testsysteme in denen zelluläre Struktureinheiten (wie. z.B. Mitochondrien oder Lysosomen) verwen- det werden. Die zelluläre Ebene stellt eine weitere Integrationsstufe dar. So wird z.B.
mit der Photosynthesehemmung die Funktionsfähigkeit von Membranen und von den, in die Photosynthese involvierten, Proteinen gemessen.
Bei der Ansammlung von Schäden werden Gewebe und dann der ganze Organismus geschädigt. Da geschädigte Organismen oft auch geschwächt sind oder ein verän- dertes Verhaltensmuster zeigen, werden sie aus einer Population verschwinden. Durch den Verlust einzelner Individuen wird eine Population geschwächt, besonders ihre Anpassungsfähigkeit an weitere Stressfaktoren nimmt ab (Largiadèr, 2001). Werden aber nicht nur einzelne Individuen einer Art vom Stressfaktor in Mitleidenschaft ge- zogen, sondern der Grossteil einer Population, so kann diese Population ihre Rolle im Ökosystem nicht mehr wahrnehmen, wodurch sich Konkurrenzverhältnisse zwischen verschiedenen Arten und auch Räuber-Beute-Beziehungen ändern können. Dies kann zu einer Verschiebung der Artenzusammensetzung im Ökosystem führen.
Da international kein einheitlicher Trend erkennbar ist, ob und wie Oberflächen- gewässer in Zukunft ökotoxikologischen Untersuchungen unterzogen werden sollen, ist der Entwicklung des Konzeptes für das Modul Ökotoxikologie eine intensive Stu- die der Literatur und eine Diskussion mit ForscherInnen in In- und Ausland voraus- gegangen. In den folgenden Abschnitten werden verschiedene ökotoxikologische An- sätze erläutert und im Sinne einer Verwendbarkeit in diesem Konzept diskutiert. Die verschiedenen Ebenen werden dabei nacheinander behandelt. Da Biomarker auf ver- schiedenen Ebenen gemessen werden können, werden sie am Ende gesondert be- Ökosystem-Ebene: Der Zustand eines Ökosystems kann dadurch erfasst werden,
dass die Artenzusammensetzung verglichen wird entweder mit historischen Daten desselben Ökosystems oder mit Daten eines hydrologisch, ökomorphologisch und chemisch vergleichbaren Ökosystems, welches unverschmutzt ist. Dieser Ansatz wird unter anderem in Grossbritannien (unter dem Namen RIVPACS) verfolgt (Wright et al., 1993). Auch im Rahmen des Modul-Stufen-Konzeptes werden in den Modulen der Biologie Bestandesaufnahmen erhoben und statistisch ausgewertet.
Ein Vorteil von Ökosystemstudien ist, dass die Anreicherung von Schadstoffen über die Nahrungskette automatisch mit in die Bewertung des Ökosystemzustandes mit eingeht, da alle Glieder einer Nahrungskette vorhanden sind. Neben der Artenzusam- mensetzung können auch weitere strukturelle Parameter eines Ökosystems untersucht werden, dazu gehören z.B. Biomasse, Chlorophyllgehalt und Prozent an Substratdek- kung. Auch funktionelle Parameter können bewertet werden, so z.B. die Primärpro- duktion, die Atmung, Nitrifikation oder die Degradationsrate.
Im Vergleich zu den anderen Untersuchungsebenen, geben die Untersuchungen auf der Ökosystemebene die Realität am besten wieder. Der Einfluss von Umweltfakto- ren, wie Wassertemperatur, Strömungsgeschwindigkeit, Habitatsveränderungen, Räu- ber-Beute-Beziehungen und Konkurrenzverhalten - um nur einige zu nennen – erlaubt aber kaum eine Diagnose hinsichtlich einer stofflichen Belastung des Ökosystems und das Erkennen eines kausalen Zusammenhanges von Effekten ist sehr schwierig bis unmöglich. So ist bei einer Änderung der Artenzusammensetzung nur schwer ein Rückschluss auf die Ursache zu ziehen. Bei niedrigen Schadstoffkonzentrationen er- folgen Änderungen sehr langsam und die Effekte sind deshalb oft erst spät wahr- nehmbar (in der Regel erst nach Monaten oder sogar Jahren).
Da es das Ziel des Modules Ökotoxikologie ist, Zusammenhänge zwischen Schadstof- fen und Effekten aufzuzeigen und als Frühwarnsystem zu dienen, ist für das Modul Ökotoxikologie ungeeignet. Ökosystemuntersuchungen können aber wichtige Infor- mationen für das Modul Ökotoxikologie liefern, da hierbei Gewässerabschnitte identi- fiziert werden, deren Zustand nicht dem natürlichen Zustand entspricht. Hier können zusätzliche ökotoxikologische Untersuchungen dann über die Rolle von Schadstoffen Aufschluss geben. Auch kann mit Ökosystemuntersuchungen – wie sie in den Modu- len der Biologie durchgeführt werden - überprüft werden, ob sich die Toxizität von Wasserproben auch negativ auf die Ökosysteme auswirken.
Modellökosysteme: Ökosystemstudien können auch an Hand von Modelökosys-
temen (Kosmen) durchgeführt werden, die im Freiland oder im Labor aufgebaut wer- den können. Kosmen stellen vereinfachte Ökosysteme dar, in denen ein Teil der Um- welteinflüsse kontrolliert werden kann. Ein weiterer Vorteil von Kosmen gegenüber der Beobachtung eines gesamten Ökosystems ist, dass eine Reihe ähnlicher Systeme untersucht werden kann. Dadurch können Kontrollen eingeführt werden und es kön- nen einfacher Zusammenhänge von Effekten und Schadstoffen hergestellt werden.
Sind mehrere trophische Stufen vorhanden, können hier auch Rückschlüsse auf die Anreicherung von Schadstoffen über die Nahrungskette gezogen werden. Kosmenstu- dien bedeuten allerdings einen sehr hohen Arbeitsaufwand und die Untersuchungen dauern in der Regel Wochen bis Jahre (je nach Grösse des Systems und der Frage- stellung des Versuchs). Deshalb sind sie für einen routinemässigen Einsatz bei einem grossen Probenaufkommen, wie es im Modul Ökotoxikologie zu erwarten ist, unge- Populationen und Organismen: Einzellige Organismen werden in diesem Bericht in
dem Abschnitt „Zellen“ diskutiert. Bei kleineren Organismen, wie z.B. Wasserflöhen, werden oft Populationen untersucht, während bei grösseren Individuen, wie z.B. Fi- sche, eher einzelne Individuen untersucht werden. Da sich das Prinzip der Unter- suchungen aber kaum unterscheidet, werden hier Populationen und Organismen zu- sammen abgehandelt. Der Einfachheit halber wird im weiteren Verlauf dieses Kapi- tels nur von Organismen gesprochen, womit auch Populationen gemeint sind. Bei den Ebenen Populationen und Organismen kann man drei verschiedeneAnsätze unter- scheiden: Feldstudien, Laborstudien und das Online-Monitoring.
Feldstudien (aktives Biomonitoring): Für die Untersuchung von Organismen im Feld, werden dazu meistens Käfige oder andere Behältnisse verwendet, die vom Wasser durchströmt werden. Dies hat den Vorteil, dass für Kontrollen und Versuch eine ein- heitliche Gruppe von Organismen verwendet werden kann und dass die Tiere nicht ihren Standort wechseln können, um Schadstoffen auszuweichen. Die Organismen bleiben meistens über Wochen oder Monate an ihren Standorten bevor sie zur Analy- se ins Labor geholt werden. Die Versuchsbedingungen (Wie Individuendichte und Nahrung etc. ) sind für die Organismen allerdings oft unnatürlich und verursachen einen zusätzlichen Stress. Das Ausbringen und Einholen der Organismen bedarf eines hohen Arbeits- und Zeitaufwandes und die anschliessenden Untersuchungen im La- bor, sind meist ebenfalls arbeitsaufwendig, da oft viele Organismen an einem Standort Laborstudien: Wenn die Reaktion von Organismen auf die Wasserqualität im Labor untersucht werden soll, können entweder Organismen verwendet werden, die natür- lich am Ort der Probenahme vorkommen, oder es können Organismen verwendet werden, die im Labor gezüchtet worden sind. Die Verwendung von standortspezifi- schen Arten hat den Vorteil, dass die ökotoxischen Untersuchungen wirklich mit Ar- ten durchgeführt werden, die für das betroffene Ökosystem relevant sind. Dieses Vor- gehen wird aber häufig dadurch erschwert, dass über die Biologie dieser Arten oft nicht genügend bekannt ist, wodurch eine artgerechte Hälterung oft schwierig ist.
Hinzu kommt, dass auch die Interpretation der Resultate ist aufgrund fehlender Ver- gleichsdaten sehr schwierig ist, vor allem bei niedrigen Schadstoffkonzentrationen, bei denen keine sehr starken Änderungen zu erwarten sind.
Deshalb wird häufig auf Organismen zurückgegriffen, die leicht im Labor zu hältern sind und deren Biologie besser bekannt ist. Dies hat den Vorteil, dass auch auf stan- dardisierte Protokolle zurückgegriffen werden kann (z.B. auf Tests aus den OECD Richtlinien, s. Tab. 1), was eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen Arbeiten und Datenbanken erleichtert. Die akute Toxizitätstests (in der Regel < 1 Woche) sind aber zu unempfindlich für Oberflächengewässer, während chronischen Tests (ihre Dauer überschreitet 10% der Lebenserwartung des Organismus) sehr teuer sind und deshalb für das Modul Ökotoxikologie nicht in Frage kommen.
Online-Monitoring: Beim Online-Monitoring werden meistens einzelne Arten be- obachtet, es können aber auch Ausschnitte eines Ökosystems (z.B. Aufwuchsgemein- schaften) untersucht werden. Hierzu werden Organismen einzeln oder in kleinen Gruppen in Behältern gehalten, durch die das zu untersuchende Wasser geleitet wird.
Das Verhalten der Organismen (z.B. Atmung oder Schwimmverhalten) wird elektro- nisch registriert und ausgewertet. Bei starken Verhaltensänderungen kommt es zu Alarmsignalen. Online-Monitoring Systeme sind relativ empfindlich (Gerhardt and Clostermann, 1998) und wurden über Jahre zur Überwachung des Rheins eingesetzt.
Dabei wurden die Organismen nach einer Woche ausgewechselt, so dass kaum eine Akkumulation von Schadstoffen stattfinden konnte und auch keine im Hinblick auf chronische Wirkungen verwertbare Ergebnisse erzielt wurden (LAWA-Arbeitskreis, 1999). Die Überwachung der Untersuchungsstationen ist aber sehr arbeitsaufwendig und deshalb wurden die Online-Monitoring Untersuchungen an vielen Stationen (un- ter anderem in Weil am Rhein) wieder eingestellt. Da im Modul Ökotoxikologie alle Schweizer Fliessgewässer untersucht werden sollen, ist es sowohl aus Kostengründen, wie auch aus Gründen des hohen Arbeitsaufwandes nicht möglich an allen Fliessge- wässer Online-Monitoring Stationen einzurichten und zu unterhalten.
Für alle Untersuchungen, in denen Organismen oder Populationen untersucht werden gilt, dass nur ein kleiner Ausschnitt an Arten untersucht werden kann, und dass die Antworten dieser Arten nur begrenzt repräsentativ sein können für das gesamte Öko- system. Ein weiterer wichtiger Nachteil ist, dass viele toxische Antworten, die sich nicht innerhalb weniger Tage oder Wochen schädlich auswirken, nicht berücksichtigt werden. Dazu gehören unter anderem Effekte auf das Hormon- und Immunsystem Zellen: Auch Zellen können in ökotoxikologischen Tests verwendet werden. Es kön-
nen entweder Zellen höherer Organismen (z.B. Fische) oder einzellige Organismen, wie z.B. einzellige Algen, Hefezellen oder Bakterien verwendet werden. Bei den Zellen höherer Organismen kann es sich um Zellen handeln, die vor jedem Versuch frisch aus dem Organismus isoliert werden (Primärzellen), oder es können Zelllinien eingesetzt werden, die sich über längere Zeit im Labor kultivieren lassen. Bei allen Zellen kann es sich entweder um genetisch unveränderte oder genetisch veränderte Zellen handeln. So können z.B. rekombinante Hefezellen eingesetzt werden, um die hormonaktive Wirkung von Wasserproben aufzudecken. Diese Zellen enthalten ein Gen für den menschlichen Östrogenrezeptor welches kombiniert ist mit einem Gen für ein Markerprotein. Mit diesen Hefezellen kann in technisch einfachen Systemen die Aktivität des Markerproteins untersucht werden, welche anzeigt, ob die Wasser- proben eine östrogene Wirkung haben (Routledge and Sumpter, 1996). Durch den Einsatz von molekularbiologischen Methoden, der sich zur Zeit hauptsächlich auf die zelluläre Ebene beschränkt, können mit Versuchen auf dieser Ebene die Wirkmecha- nismen eines Schadstoffes genauer untersucht werden. Der Einsatz rekombinanter Mikroorganismen und rekombinanter Zellen höherer Organismen ermöglicht die Un- tersuchung verschiedener, chronischer Wirkmechanismen (z.B. östrogene, androgene und progestogene Wirkungen (Ackermann, 2000; Gracía-Reyero et al., 2001; Rout- ledge and Sumpter, 1996) oder DNA-Schäden (Schweigert et al., 1999)). Es werden in den nächsten Jahren sehr wahrscheinliche noch weitere Wirkmechanismen hinzu- Versuche mit zellulären Systemen dauern meist wenige Stunden, in Ausnahmenfällen Tage. Ein weiterer Vorteil ist, dass keine Tiere eingesetzt werden müssen (zumindest nicht, wenn kultivierbare Zelllinien verwendet werden) und dass die Versuche nur wenig Laborplatz beanspruchen. Viele dieser Versuche können in sogenannten Mi- krotiterplatten durchgeführt werden, wodurch viele Proben in einem einzigen Versuch untersucht werden können. Auch dies ist gute Voraussetzung zur Automatisierbarkeit, was bei einem routinemässigen Einsatz von grossem Vorteil wäre. Die Kosten der Untersuchungen sind beim Einsatz von Mikrotiterplatten gering. Nachteile von Unter- suchungen auf der zellulären Ebene sind, dass – wie auch schon auf der Organisme- nebene – eine Auswahl des zu untersuchenden Organismus getroffen werden muss, bei der zellulären Ebene kommt hinzu, dass auch der Zelltyp ausgewählt werden muss. Auf der zellulären Ebene kann nur ein toxisches Potential von Wasserproben bestimmt werden. Ob die Wasserprobe auf einer biologischen Ebene zu toxischen Effekten führt, muss auf einer höheren biologischen Ebene (z.B. Organismen) über- subzelluläre Ebene: Für Untersuchungen auf der subzellulären Ebene werden Zell-
bestandteile (z.B. Mitochondrien, Membranvesikel oder Lysosomen) den zu unter- suchenden Wasserproben ausgesetzt. Der Vorteil dieser Untersuchungen ist, dass Schäden analysiert werden können, ohne dass sie durch zelluläre Reparatursysteme wieder repariert werden. Dies hat aber auch einen Nachteil: Die Zahl der gemessenen Schäden, ist im Vergleich zur zellulären Ebene, in der die Reparatursysteme aktiv sind, erheblich höher. Um alle möglich toxischen Wirkmechanismen von Chemikali- en erfassen zu können, sind auf der subzellulären Ebene sehr viele Testsysteme not- wendig. Dies würde den Ausmass einer Screeningtestbatterie, wie sie im Rahmen des Moduls Ökotoxikologie möglich wäre, überschreiten. Tests der subzellulären Ebene eignen sich aber als Frühwarnsystem, um bestimmte Gefahrenpotentiale abzuschätzen molekulare Ebene: Auf dieser Ebene werden die Bausteine der Zelle, z.B. die DNA
direkt den Wasserproben ausgesetzt und die Schäden werden anschliessend gemessen.
Die grossen Vorteile der molekularen Ebene bestehen darin, dass einerseits die von Schadstoffen hervorgerufenen Schäden sich zuerst auf dieser Ebene etablieren, das heisst auf dieser Ebene als erstes zu messen sind. Da die Bausteine der Zellen (z.B.
DNA, Lipide) in allen Organismen relativ ähnlich aufgebaut sind, sind die Schäden auf dieser Ebene auch bei allen Organismen relativ einheitlich. Allerdings gilt auch auf der molekularen Ebene, dass keine Reparatursysteme aktiv sind. Die Anzahl der Testsysteme, die zur Erfassung aller möglichen toxischen Antworten notwendig wäre, wäre noch grösser als auf der subzellulären Ebene, da die molekulare Ebene die nied- Biomarker: Unter Biomarker verstehen wir molekularbiologische, biochemische und
physiologische Reaktionen auf Stressbedingungen. Biomarker werden in diesem Be- richt gesondert behandelt, da sie auf verschiedenen Ebenen gemessen werden können.
In den letzten Jahren hat die Anzahl von Biomarkeruntersuchungen in der Ökotoxi- kologie stark zugenommen, wie auch die Herausgabe der neuen internationalen Zeit- schrift „Biomarkers“ zeigt. Untersucht werden können DNA-Addukte, Membransta- bilitäten, und die Konzentration oder Aktivität von Proteinen (z.B. metallbindende Proteine oder detoxifzierende Enzyme, wie die Cytochrom P-450 Gruppe), als auch Verhaltensänderungen von Organismen. Von daher können Biomarkeruntersuchun- gen auch auf einer grossen Breite der biologischen Ebenen durchgeführt werden.
Diese Zusammenfassung möglicher ökotoxikologischer Ansätze soll einen kurzen Einblick in die Ökotoxikologie geben und ist weit davon entfernt vollständig zu sein.
Für eine regelmässige Untersuchung von Fliessgewässerproben ist es notwendig, dass viele Proben mit schnellen, preisgünstigen aber sensitiven Methoden untersucht wer- den. Am geeigneten dafür sind die zellulären Ansätze.
3. Das Konzept für das Modul Ökotoxikologie In Fliessgewässern liegt ein unbekanntes Gemisch von Chemikalien vor, welches in Organismen viele verschiede toxische Effekte hervorrufen kann. Es gibt leider keinen Schnelltest mit dem die Bandbreite der möglichen toxischen Wirkungen dieses Schadstoffgemisches abgedeckt werden kann. Deshalb macht es auch für das Modul Ökotoxikologie wenig Sinn drei verschiedene Vorgehensweisen für die Stufen F, S und A des MSK zu entwickeln, wo für die Stufe F eine geringe Untersuchungstiefe mit wenigen preisgünstigen und schnellen Tests gefordert ist. Im Modul Ökotoxiko- logie braucht es als Minimum aber eine Testbatterie, um die wichtigsten toxischen Wir schlagen daher vor, dass im Modul Ökotoxikologie alle Wasserproben den glei- chen Untersuchungen unterzogen werden. Diese Untersuchungen sind in zwei Stufen anzuordnen (Abb. 1). In der ersten Stufe wird ein Screening durchgeführt, in dem überprüft wird, ob die Wasserproben ein toxisches Potential haben. Es sollen dabei soweit wie möglich alle relevanten toxischen Antworten abgedeckt werden. Wasser- proben, die ein toxisches Potential aufweisen, sollen anschliessend in der 2. Stufe weiter untersucht werden. Dabei soll überprüft werden, ob dieses toxische Potential auf einer höheren Ebene, z.B. der Organismen-Ebene, zum Ausdruck kommt.
Abbildung 1. Vorgehensweise beim Modul Ökotoxikologie.
Die Anwendung ökotoxikologischer Tests bedingt, dass am Standort die Entnahme repräsentativer Proben möglich ist. Bei Wasser und Abwasserproben bieten sich Sammelproben (z.B. Wochenproben) an, bei Sedimentproben ist die Entnahme von Replikaten notwendig, da die Schadstoff-Konzentrationen im Sediment auf engen Raum stark schwanken können (Stemmer et al., 1990). Bei der Probenahme ist eine Zusammenarbeit mit den anderen Modulen, vor allem den Modulen der Biologie und Chemie wünschenswert, um den Aufwand für die Module so gering wie möglich zu halten. Finden die Untersuchungen in den verschiedenen Modulen and den gleichen Stellen statt, kann dies die Interpretation der Ergebnisse der einzelnen Module stark erleichtern. Die Wasserproben, die direkt im Fliessgewässer genommen werden, müs- sen für ökotoxikologische Untersuchungen wahrscheinlich aufkonzentriert werden.
Dazu sind in den letzten Jahre eine Anzahl Methoden entwickelt worden (Hendriks et al., 1994; Parkerton et al., 2000; Verbruggen et al., 2000; Verbruggen et al., 1999).
3.2. Stufe 1: Screening von Wasserproben auf ihr toxisches Potential In dieser Stufe sollen relevante toxische Antworten abgedeckt werden. Zu den heute bekannten toxischen Antworten zählen: die direkte Zelltoxizität, Photosynthese- hemmung, DNA-Schäden, Teratogenese (Keimschäden), Neurotoxizität, Reproduk- tionsschäden, nicht durch DNA-schädigende Chemikalien verursachter Krebs und Auswahl der Vorgehensweise anhand eines Kriterienkataloges Da bei einer routinemässigen Fliessgewässerbewertung viele Wasserproben unter- sucht werden müssen, ist es wichtig, ein Screeningsystem aufzubauen, welches einer- seits kostengünstig ist und schnell zu Antworten führt, andererseits aber auch sensitiv ist. In diesem Abschnitt werden die einzelnen Auswahlkriterien kurz diskutiert und in Die Ökosystemrelevanz ist am höchsten, wenn die Schadstoffeffekte im Ökosystem
selber untersucht werden. Die Ökosystemrelevanz nimmt von der Ebene des Ökosy- stems hin zur molekularen Ebene immer weiter ab. Testverfahren, die auf zellulären Methoden beruhen haben daher in erster Linie keine sehr hohe Ökosystemrelevanz.
Mit ihnen kann aber in Screeningstests das toxische Potential von Wasserproben er- fasst werden, welches anschliessend auf einer höheren Ebene untersucht werden kann.
Die Sensitivität von Testsystemen spielt bei der Auswahl der Vorgehensweise eine
entscheidende Rolle. Eine hohe Sensitivität weisen molekulare und subzelluläre Me- thoden auf, wenn die Effektkonzentration auf die Wirkortkonzentration bezogen wird (Escher et al., 1997; Gülden et al., 2001; Gülden and Seibert, 1997; Schweigert et al., 2000). Da aber eine gründliche Erfassung des toxischen Potentials den Rahmen des Moduls Ökotoxikologie sprengen würde, werden hier nur die praktikableren biologi- schen Ebenen diskutiert. Der Einfluss von niedrigen Schadstoffkonzentrationen kann einerseits mit chronischen Expositionen von Organismen oder Ökosystemen nachge- wiesen werden, da chronische Tests fast immer sensitiver sind als akute Tests (Koller et al., 2000). Durch den Einsatz von molekularbiologischen Methoden in zellulären Testsystemen können chronische Effekte, die durch niedrige Schadstoffkonzen- trationen verursacht werden, auch schon innerhalb von Stunden oder wenigen Tagen in zellulären Systemen nachgewiesen werden (Ackermann, 2000; Gracía-Reyero et al., 2001; Routledge and Sumpter, 1996).
Innerhalb der biologischen Stufen nimmt die Schnelligkeit mit der sich Schadstoff-
effekte etablieren, vom Ökosystem zum Molekül immer weiter zu (Adams et al., 2000). Dies trifft vor allem bei niedrigen Schadstoffkonzentrationen zu. Während auf der molekularen oder zellulären Stufe die Effekte innerhalb von Minuten oder Stun- den (in Ausnahmefällen Tagen) gemessen werden können (Oda et al., 1985; Routled- ge and Sumpter, 1996; Schreiber, 1994), dauert es im Lebensgemeinschaften Wo- chen, Monate oder sogar Jahre bis Jahrzehnte bis sich die Effekt messbar etabliert haben (Schindler, 1987; Soldo and Behra, 2000). Für einen hohen Probenumsatz ist es auch wichtig, dass die Untersuchungen so weit wie möglich automatisiert werden können, so dass der Arbeitsaufwand und damit die Kosten niedrig gehalten werden können. Eine Automatisierbarkeit ist aber weder bei Ökosystem- oder Modellöko-
systemuntersuchungen oder Organismenstudien derzeit absehbar. Nur im Online- Monitoring von Organismen ist eine Automatisierbarkeit erreicht worden (Gerhardt and Clostermann, 1998). Da zelluläre Tests oft in Mikrotiterplatten durchgeführt wer- den können, ist es hier durchaus vorstellbar, dass später eine Automatisierbarkeit möglich wäre. Für die molekulare Ebene, wäre dieses auch denkbar.
Die Kosten sind stark abhängig von der zu untersuchenden Ebene. Während gründli-
che Untersuchungen im Ökosystem oder mit Modellökosystemen Kosten von hun- derttausend Franken und mehr verursachen können, kosten akute Organismentests im Auftragslabor um die tausend Franken. Bei zellulären Tests kann mit deutlich gerin- geren Kosten gerechnet werden, vor allem wenn mehrere Proben gleichzeitig in Mi- krotiterplatten untersucht werden können. Den Kosten für die experimentelle Durch- führung stehen die Kosten für die Probenahme gegenüber, welche je nach Entfernung und Zugänglichkeit stark variieren können Da Probenahmen zeitaufwendig sind (hierbei sind vor allem die Personalkosten zu beachten) können sie die Kosten der experimentellen Teils überschreiten.
Auch die ethische Gesichtspunkte haben bei der Wahl der Vorgehensweise eine
entscheidende Rolle gespielt. Unter diesem Kriterium schneiden molekulare, subzel- lulläre und zelluläre Testsysteme positiv ab, wenn dafür nicht immer wieder auf frisch isolierte Zellen höherer Organismen zurückgegriffen werden müssen. Dies kann durch die Verwendung von Mikroorganismen und kultivierbaren Zelllinien höherer Organismen verhindert werden, wie bei der Messung von östrogen-aktiven Substan- zen gezeigt werden konnte (Ackermann, 2000; Routledge and Sumpter, 1996). In Tabelle 2 sind die von uns verwendeten Auswahlkriterien für ökotoxikologische Tests zusammengestellt und die einzelnen Untersuchungsebenen vom Ökosystem bis zum Tabelle 2. Auswahlkriterien für die Tests der Screening-Testbatterie der 1. Stufe
Ebene des Ökosystem- Sensitivität 1 Wenn die Zellen oder Moleküle frisch aus Organismen isoliert werden, ist die Ethik negativ zu be-werten, werden aber Zelllinien verwendet, so ist sie positiv zu bewerten.
Aus Tabelle 2 wird ersichtlich, dass sich vor allem Tests auf der (sub-)zellulären Ebe- ne zu einem Screening vieler Wasserproben eignen. Mit dem Einsatz einer Testbatte- rie, in der die verschiedenen möglichen toxischen Wirkungen auf die verschiedenen Organismen untersucht werden, kann das Potential abgeschätzt werden, welches Was- serproben auf Organismen bzw. ein Ökosystem haben könnten. Dieses toxische Po- tential muss dann mit einem Test auf höherer biologischer Ebene überprüft werden.
Entsprechend ist das Modul Ökotoxikologie aufgebaut.
3.2.2. Die Screening-Testbatterie der 1. Stufe In den nächsten Abschnitten werden Testsysteme vorgestellt, die für eine Anwendung in dieser Screening-Testbatterie in Erwägung gezogen werden. Es soll hier in diesem Zusammenhang betont werden, dass wir bei der Auswahl der Testsysteme diejenigen bevorzugt haben, die sich auf internationaler Ebene in der Praxis oder Forschung eta- bliert oder durchgesetzt haben. Diese Auswahl ist aber nicht endgültig und kann bei der Entwicklung neuer Testsysteme oder zusätzlichen wissenschaftlichen Erkenntnis- sen von bestehenden Testsystemen angepasst werden. Die Screening-Testbatterie kann auch erweitert werden, falls toxische Antworten entdeckt werden, die mit der hier vorgestellten Batterie nicht abgedeckt werden.
Einige toxische Antworten, wie Teratogenese (Keimschäden) und Störungen der Im- munantwort, sind mit zellulären Testsystemen nicht zu erfassen, da sie auf komplexen Mechanismen beruhen, in denen zell- und organübergreifende Interaktionen eine • Direkte Zelltoxizität: Die direkte Zelltoxizität kann durch viele verschiedene Mechanismen hervorgerufen werden. Als Testsysteme haben wir den Micro- tox®, bzw. Lumistox® Test (Link, 1990) und den MetPLATE™ (Bitton et al., 1994; Bitton and Koopman, 1992) ausgewählt. Der Microtox®-Test ist bereits standardisiert (Standardization, 1998a;b;c), dieser Test wird zur Zeit haupt- sächlich in Küvetten durchgeführt, es gibt aber Entwicklungsansätze für ein Mikrotiterplattenverfahren. Diese Entwicklung wäre für das Modul Ökotoxi- kologie wünschenswert. Der Microtox®-Test ist bekannterweise sensitiv für organische Schadstoffe, während MetPLATE™ speziell für Metalle sensitiv • Photosynthese-Hemmung: Die Photosynthese dient pflanzlichen Zellen, Algen und einigen Bakterien zur Energiegewinnung. Eine Hemmung der Photosyn- these und damit eine verminderte Primärproduktion wirkt sich in der Regel negativ auf ein Ökosystem aus, es ist von daher notwendig die Effekte auf die Photosynthese in dieser Testbatterie mit zu erfassen. Das von uns ausgewählte Testsystem (Puls Amplituden modulierte Fluoreszenz; PAMF) misst die Hemmung der Photosynthese mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz (Schreiber, 1994). Es ist an der EAWAG mit verschiedenen Pestiziden ausgetestet worden und hat sich im Vergleich zu Literaturdaten als eines der sensitivsten Messsy- • DNA-Schäden: Für die Messung von DNA-Schäden wurde ein bakterielles Testsystem ausgewählt, in dem nicht die DNA-Schäden selber gemessen wer- den, sondern die Induktion eines DNA-Reparaturmechanismus, mit dem die meisten DNA-Schäden repariert werden. Hierfür schlagen wir aufgrund von Diskussionen mit Gert-Jan de Maagd (RIZA, Niederlande), welcher drei bak- terielle Muatgenizitätstest verglichen hat, den umuC Test vor (DIN 38415-3, 1996; Oda et al., 1985). Da die meisten Bakterien nur ein Chromosom besit- zen, können Schäden, wie Chromosomenaberration, die Bildung von Micro- nuclei und der Austausch von Chromosomenstücken, wie sie in Eukaryonten- Zellen vorkommen können, nicht untersucht werden (Houk, 1992). Deshalb sollte noch ein zusätzlicher Test für diese Eukaryonten-spezifischen DNA- Schäden mit in die Testbatterie aufgenommen werden. Es gibt aber momen- tan noch keinen Test, der die Ansprüche eines Screeningtests erfüllt und mit dem alle diese Schäden gemessen werden können.
• Reproduktionsschäden werden häufig durch hormonaktive Schadstoffe in der Umwelt verursacht (Vos et al., 2000). Für die Untersuchung von östrogenen Wirkungen sind in den letzten Jahren eine Reihe von Screeningtests entwik- kelt worden. In der aquatischen Ökotoxikologie werden dazu entweder Fisch- zelllinien oder Hefezellen verwendet (Arnold et al., 1996; Gagne and Blaise, 2000; Gracía-Reyero et al., 2001; Islinger et al., 1999; Routledge and Sump- ter, 1996). Ein bereits an der EAWAG erprobtes Hefetestsystem ist der von Routledge und Sumpter entwickelte „YES-Assay“ (yeast estrogen system as- say) (Routledge and Sumpter, 1996). Da sich Testsysteme mit Hefezellen und Fischzellinien nicht sehr in ihrer qualitativen und quantitativen Aussage ver- gleichbar (Rutishauser et al., 2001), Hefezellen aber einfacher zu handhaben sind und sich im Rahmen des EU-Comprehend Projektes bewährt haben (www.ife.ac.uk/comprehend/), schlagen wir den Einsatz von Hefezellen vor.
Auch für die Untersuchung anderer hormoneller Wirkungen sind Screening- tests entwickelt worden. Um die androgene Wirkung von Wasserproben zu messen, ist ein, dem YES-Assay entsprechender Test (YAS-assay), entwickelt worden. Auch dieser Test soll mit in die Testbatterie aufgenommen werden.
Die Interaktion von Chemikalien mit dem Progesteronrezeptor von Fischen konnte inzwischen auch gezeigt werden (Thomas, 2000), auch für diese Schadwirkung gibt es bereits einen Hefeassay (Gracía-Reyero et al., 2001).
Für weitere hormonelle Wirkungen sind uns zur Zeit noch keine Screeningtest bekannt, aber es ist zu erwarten, dass in naher Zukunft auch die Interaktion von Schadstoffen mit anderen Hormonrezeptoren in Screeningtests untersucht • Keimschäden (Teratogenese): Für die Untersuchung von Keimschäden stehen, wie bereits erwähnt, keine zellulären Testsysteme zur Verfügung. Tests, die für die Untersuchung der keimschädigenden Wirkung von Schadstoffen einge- setzt werden, verwenden befruchtete Eizellen von Fischen (OECD Richtlinie 210) oder Amphibien (Fort et al., 2000; OECD, 2000). In diesen Tests wird die Entwicklung des Embryos bis kurz vor dem Schlüpfen verfolgt. Der Test kann aber auch nach 48 Stunden beendet werden (Schulte and Nagel, 1994).
Da dieser Test darauf beruht, Veränderungen der Embryonen mit dem Mikro- skop festzustellen, bedeutet dies einen grösseren Arbeitsaufwand, als es für einen Screeningtest angebracht wäre. Es scheint uns aber trotzdem notwendig, diesen Test mit in die Testbatterie mit aufzunehmen, da Keimschäden für eine Population und für ein Ökosystem schwerwiegende Folgen haben können.
• Immunotoxizität: In der Immunotoxikologie werden Schäden am Immunsy- stem aufgedeckt, welche den Organismus schwächen. In den letzten Jahren sind auch zelluläre Testsysteme entwickelt worden. Sie sind aber sehr ar- beitsaufwendig und deshalb nicht unbedingt für ein Screeningtest geeignet (Anderson and Zeeman, 1995). Mit den verschiedenen Testsystemen können auch nur kleine Ausschnitte der Immunotoxizität abgedeckt werden. Zur Zeit ist der Einsatz von 4-5 aufwendigen Tests notwendig, um diese toxische Ant- wort abzudecken (Köllner, 2001). Deshalb werden wir die Immunotoxizität anfänglich noch nicht mit in die Testbatterie der 1. Stufe aufnehmen können.
• Neurotoxizität: Auch für die Neurotoxizität (Störungen im Bereich des Ner- vensystems) sind uns keine Testsysteme bekannt mit welchem ein Grossteil der neurotoxischen Effekte erfasst werden kann, und welche für einen Einsatz in einer Testbatterie geeignet wären (Hawkins et al., 1995; Kier, 1987; van Delft et al., 1998). Im Oktober 2001 hat das europäische Zentrum zur Validie- rung alternativer Methoden (ECVAM) ein Workschop stattgefunden, indem die Möglichkeiten von in vitro Methoden zur Erfassung von Neurotoxizität diskutiert worden sind. Ein Testsystem mit embryonalen Hirnzellaggregaten von Ratten soll jetzt in die Vorvalidierungsphase gehen (http://www.forschung3r.ch/de/publications/bu15.html), aber für aquatische Organismen sind noch keine Testsysteme soweit entwickelt (Honegger, pers.
• Krebs, ausgelöst durch nicht DNA-schädigende Chemikalien: Zu den krebser- regenden Stoffen zählen viele Chemikalien, die DNA-Schäden verursachen, aber es gibt auch Chemikalien, die Krebs verursachen ohne die DNA zu schä- digen (Hawkins et al., 1995). Die Mechanismen, die zu diesem sogenannten nicht-genotoxischen Krebs führen, sind bisher kaum verstanden, zur Zeit gibt es auch noch keinen Screeningtest für krebserregende Stoffen, mit dem alle nicht DNA-schädigende Stoffe erkannt werden können (Hawkins et al., 1995; Kier, 1987; van Delft et al., 1998). Da Krebs bei aquatischen Organismen, ge- nau wie beim Menschen, in der Regel erst imfortgeschrittenen Alter auftritt und daher die Reproduktion selten beeinflusst, hat er wenig Auswirkungen auf die Populationsdichte und das Ökosystem. Wir halten daher die Untersuchung auf krebserregende Substanzen nicht für prioritär und werden entsprechende Test vorerst nicht mit in die Screening-Testbatterie mit aufnehmen.
In der 2. Stufe des Moduls Ökotoxikologie sollen die Wasserproben weiter untersucht werden, die in der Screening-Testbatterie zu einer oder mehreren positiven Antworten geführt haben. In dieser 2. Stufe soll überprüft werden, ob die positive Antwort auf der zellulären Ebene auch auf die Organismenebene übertragbar ist, oder ob in Orga- nismen kein Effekt mehr festgestellt werden kann. Mit welchen Organismen und Testverfahren die Versuche der 2. Stufe durchgeführt werden, wird einerseits davon abhängen, welche Tests in der ersten Stufe positiv waren und aus welcher Gegend die Probe stammt. Sind in der 1. Stufe extrahierte Sedimentproben untersucht worden, so sind hier in der 2. Stufe auch Sedimenzorganismen zu verwenden. Generell sollen bei allen toxischen Antworten (ausser Photosynthese-Hemmung) in der 2. Stufe Rele- vanzprüfungen mit Vertebraten (Fischen) und Invertebraten durchgeführt werden.
Man muss sich aber darüber im Klaren sein, dass die Entwicklung von Testsystemen für Vertebraten viel weiter fortgeschritten ist, und dass von daher der Einsatz von Invertebraten-Testsystemen nicht von Anfang an stattfinden kann. Für die Entschei- dung über die zu verwendenden Organismen und Testsysteme sind, zumindest in der ersten Zeit, Experten hinzuzuziehen. Eine Verwendung von Organismen, die in den betroffenen Gewässern natürlicherweise anzutreffen sind, ist zu bevorzugen. Es kön- nen aber nur Arten verwendet werden, die kultiviert und deren biologischen Ansprü- che einigermassen bekannt sind. Am Anfang wird wahrscheinlich von Fall zu Fall entschieden werden müssen, welche Organismen in dieser Stufe untersucht werden sollen und wie ein Versuch aufzubauen ist, um die toxische Antwort des Screening- tests zu überprüfen. Aus praxisorientierten Gründen ist aber auf die Dauer die Ver- wendung einiger weniger Arten anzustreben. Die Wahl des Testsystemes wird sich auch unterscheiden, wenn eine akute toxische Antwort überprüft werden soll, oder wenn Effekte auf die Reproduktion zu erwarten sind.
3.4. TIE (Toxicity-Identification-Evaluation) Wenn sich eine toxische Antwort in der 2. Stufe bestätigt hat, so muss der oder die Schadstoff(e), wenn möglich, identifiziert werden, denn nur so kann eine Reduktion der Einleitung erreicht werden. Bei einem TIE werden die Wasserproben in verschie- den Schritten aufgearbeitet (z.B. durch pH-Veränderung) und fraktioniert (z.B. mit C18-Säulen). Nach den einzelnen Schritten kann die Toxizität mittels des positiven Screeningtests wieder überprüft werden. Die US-amerikanische Umweltbehörde hat ausführliche Empfehlungen zum Vorgehen bei einem TIE veröffentlicht (EPA, 1991;1993a;b). Die einzelnen Fraktionen können zwischendurch mit dem Screening- test, welcher in der ersten Stufe positiv war, getestet werden. Am Ende muss versucht werden, den Schadstoff mittels chemischer Analysen, zu identifizieren.
4. Das Modul Ökotoxikologie im Rahmen des MSK Das Modul Ökotoxikologie kann im MSK die Brücke zwischen dem Chemie-Modul und den Modulen der Biologie schlagen, indem leichter Zusammenhänge zwischen der chemischen Belastung und Änderungen im Ökosystem überprüft werden können.
Die Module der Biologie können der Ökotoxikologie darüber Daten liefern, in wel- chen untersuchten Ökosystemen negative Einflüsse erkennbar sind, die keine eindeu- tige Ursache haben. Das Modul Chemie kann wiederum Hinweise auf das Vorliegen verdächtiger Stoffe liefern, welche als Trigger für ökotoxische Untersuchungen die- nen können. Für eine endgültige Identifikation toxischer Stoffe ist die Chemie auch Wenn in Stichproben ökotoxikologische Potentiale aufgedeckt werden, sollte dies in den anderen Modulen der Biologie und Chemie berücksichtigt werden, und intensive chemische und biologische Untersuchungen sollten eingeleitet werden. Eine enge Zusammenarbeit dieser Module ist eine notwendige Voraussetzung für eine erfolgrei- che umfassende Fliessgewässerbewertung durch das MSK.
Da wir bei der Umsetzung dieses Konzepts noch am Anfang stehen, gibt es auch noch viele offene Fragen, die vor einem routinemässigen Einsatz zu lösen sind. Es stehen zur Zeit noch nicht für alle toxische Antworten Screeningtests zur Verfügung, die in der Testbatterie der 1. Stufe eingesetzt werden können. Sobald aber geeignete Tests entwickelt worden sind, können sie mit in die Testbatterie aufgenommen werden.
Eine Frage, die momentan noch nicht beantwortet werden kann, ist, wie stark die Antwort im Screeningtest sein müssen, um sie als positiv zu bezeichnen und einen Test der 2. Stufe durchzuführen. Diese Frage kann erst beantwortet werden, wenn die einzelnen Testmethoden aufgebaut und die toxischen Antworten aus Stufe 1 mit den Effekten in Stufe 2 hinreichend verglichen worden sind. Auch in der 2. Stufe wird sich die Frage stellen, wie stark die Antwort sein muss, um sie als positiv zu bezeich- nen und anschliessend ein TIE durchzuführen. Auch die Auswahl der Organismen und Methoden der 2. Stufe ist derzeit, wie bereits erwähnt, noch offen.
An der EAWAG wird jetzt eine Machbarkeitsstudie zum Modul Ökotoxikologie durchgeführt. Das erste Ziel ist die Zusammenstellung und das Austesten der Scree- ning-Testbatterie der 1. Stufe, dazu werden Methoden verwendet, die bereits in der Forschung etabliert sind. Die einzelnen Testverfahren werden mit einzelnen Chemi- kalien, Chemikaliengemischen und Umweltproben auf ihre Sensitivität und Robust- heit geprüft. Es werden Protokolle entwickelt, die eine standardisierte Verwendung der Methoden erlauben. Die Übertragbarkeit der Ergebnisse der 1. Stufe auf die 2.
Stufe soll in Zusammenarbeit mit anderen Instituten (z.B. RIZA in den Niederlanden) Wir möchten uns bei der EAWAG für die finanzielle Unterstüzung zur Erarbeitung dieses Konzeptes bedanken. Weiterer Dank gilt allen Diskussionspartnern, die mit Ideen und konstruktiver Kritik bei der Ausarbeitung mitgeholfen haben.
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